Utjecaj vorteks antene na tumorske i normalne stanice in vitro
Tretman:
a) Određivan je utjecaj vorteks antene na rast tumorskih staničnih linija: adenokarcinoma maternice (HeLa), adenokarcinoma gušterače (MIAPaCa-2), karcinoma debelog crijeva (CaCo-2), kronične mijeloidne leukemije u blastičnoj krizi (K562), Burkittov-og limfoma (RAJI) i normalnih epitelnih stanica bubrega psa (MDCK) nakon jednokratnog izlaganja. Stanice su uzgojene i u pokus stavljene u koncentraciji 2*105st/ml u ukupnom volumenu od 3 ml u pločicama sa 6 jažica u odgovarajućem mediju za uzgoj stanica.
b) Prije tretmana stanice su pregledane mikroskopom i ostavljene na anteni preko noći na sobnoj temperaturi u biološkom kabinetu tijekom 18 sati. Kontrolne stanice su isto tako bile smještene u biološkom kabinetu udaljene od antene i stanica na njoj oko 1m. Po završetku izlaganja, tretirane i kontrolne stanice pogledane su pod mikroskopom i slikane.
c) Tijekom slijedećih 24 do 72 sata izložene i kontrolne stanice inkubirane su u CO2 inkubatoru. Nakon inkubacije određen je broj stanica i mikroskopom su tražene morfološke promjene koje bi upućivale na tip smrti stanica kao i promjene u njihovom rastu. Po završetku inkubacije broj živih stanica određen je bojanjem s tripanskim modrilom.
Rezultati:
a) Uočen je zastoj u rastu tretiranih leukemijskih stanica (K562) i stanica limfoma (RAJI) u odnosu na kontrolne stanice za 18,3% odnosno 16,1% nakon 72 sata od tretmana. Isključen je mogući utjecaj boravka stanica izvan inkubatora na rast i diobu istih. Stanice (Slika 1) izgledaju dobro bez vidljivih promjena u morfologiji.
b) Stanice adenokarcinoma gušterače (MIAPaCa-2): nisu uočene morfološke promjene nakon izlaganja stanica, 24 i 72 sata nakon izlaganja (Slika 2c i d). Utvrđen je zastoj u rastu od 16,5% 24 sata nakon izlaganja i 23,6% 72 sata nakon izlaganja. Ove stanice su izuzetno otporne na sve poznate kemoterapeutike tako da ne bi trebalo zanemariti i ovako skroman učinak.
c) Stanice karcinoma debelog crijeva (CaCo-2) 24 sata nakon izlaganja pokazuju neznatno smanjenje broja stanica. Primijećenih 8% je i skladu s uobičajenim brojem stanica koje u ovoj tumorskoj staničnoj liniji spontano umiru apoptozom tako da se uočeno smanjenje broja stanica ne može povezati s izlaganjem djelovanju antene. Nisu uočene promjene u morfologiji stanica (Slika 3e i f). Utvrđen zastoj u rastu od 17% u odnosu na kontrolne stanice 72 sata nakon izlaganja može se povezati s djelovanjem antene.
d) Stanice adenokarcinoma maternice HeLa: odmah nakon izlaganja (18 sati) (Slika 2a,b) ne uočavaju se morfološke promjene u tretiranim u odnosu na kontrolne stanice. 24 sata nakon izlaganja smanjen je broj stanica u odnosu na kontrolne za 12,8%. 48 sati nakon izlaganja uočavaju se brojne morfološke promjene koje ukazuju na smrt stanica. Stanice su okrugle i odljepljene od podloge, a broj stanica izloženih anteni smanjen je za 28% (Tablica 1, Slika 4) u odnosu na kontrolne stanice.
e) Normalne epitelne stanice MDCK I pokazale su se osjetljivima 24 sata nakon izlaganja, no vrlo brzo su se oporavile, dijelile su se u skladu s novim generacijskim vremenom i postale su 100% konfluentne (Slika 3g,h).
NAPOMENA:
Stanice in vitro trebaju se uzgajati u CO2 inkubatoru radi acidobazne ravnoteže koja je neophodna za normalan rast, razvoj i umnožavanje stanica. Za potrebe ovog pokusa stanice smo držali dulje vrijeme izvan inkubatora. Većina stanica pokazala se otpornim na sobnu temperaturu. Svakako bi se trebao osmisliti pokus s višekratnim izlaganjem, Osnovni problem u kreiranju takvog ispitivanja je nemogućnost držanja antene u električnim uređajima. Tako da medij za uzgoj stanica koji bi mogao stajati na anteni i s njim tretirati stanice svaki dan mora biti u hladnjaku zbog moguće razgradnje sastojaka medija, ali i mikrobiološke kontaminacije. Stanice isto tako nije mogućesvaki dan držati na sobnoj temperaturi jer im se metabolizam mijenja.